细胞作为机体的基本单元，在特定的空间位置与微环境协同，发挥其特有的生物学功能，所以对于研究和理解细胞生物学、肿瘤生物学、发育生物学等学科的发生机制来说，空间位置信息尤为重要。空间转录组是近年来热门的高通量测序技术，该技术结合显微成像和测序技术在获得基因表达数据的同时最大程度的保留样本的空间位置信息，为组织细胞功能、微环境互作、发育过程谱系追踪、疾病病理学等多个领域提供了重要的研究手段。2022年6月17日，William H. Hudson和Lisa J. Sudmeier在Cell旗下的STAR Protocols杂志在线发表了题为“Localization of T cell clonotypes using the Visium spatial transcriptomics platform”的研究方案论文。作者利用10×Genomics Visium空间转录组技术在组织切片中定位T细胞克隆。该技术能对人类T细胞的空间定位进行详细研究，如肿瘤微环境中浸润型T细胞克隆的定位等。在文中，作者阐述了Visium空间转录平台上定位T细胞克隆的实验方案（图1）。该方案主要为（1）新鲜冰冻组织冷冻切片后贴于Visium基因表达芯片，染色成像，组织mRNA被芯片上oligo探针捕获，并以mRNA为模板逆转录合成cDNA；（2）step1:洗脱后cDNA进行TCR特异性扩增，生成带Read1、Read2、空间barcode、UMI和TCR CDR3序列的产物；（3）step:TCR特异性扩增产物建库、测序；（4）step3：TCR克隆鉴定(5）step4:TCR克隆空间定位图1 Visium空间转录组平台定位T细胞克隆技术路线为了更好说明Visium空间转录组对人T细胞克隆的定位，本文作者对该技术原理及方案进行了详细描述。首先，制备6例人肿瘤脑转移冷冻OCT包埋样本，以10μm/片冷冻切片，贴于表达芯片捕获区域内，HE染色（也支持免疫荧光染色）成像，表达芯片上样本切片经透化后（新鲜组织需先摸索组织切片的目标区域透化条件），表达芯片捕获区域spot上连接的寡核苷酸序列捕获mRNA polyA尾，如图2A所示，每条寡核苷酸序列的5’端包含Read1序列，16碱基的空间条形码（barcode）和12碱基的UMI，3’端为poly dT。捕获样本mRNA后，以mRNA为模板逆转录合成带Read1序列、空间barcode、UMI及样本基因表达信息等的cDNA第一链，同时在3’端添加一段模板交换序列（TSO），最后以与TSO序列互补的引物起始第二链扩增，最后KOH洗脱获得cDNA第二链（图2B）。洗脱后cDNA一部分直接用于构建基因表达文库，剩余部分进行TCR或其他特异性基因扩增（如B细胞受体BCR）。为了扩增TCRβ CDR3序列，合成45条覆盖不同TRBV序列且包含Read2序列的引物，混合成相同浓度的引物池作为5’端特异性引物，3’端引物为Read1序列（图2C）。TCR特异性扩增产物磁珠纯化后直接建库测序。测序后，以TCR CDR3序列识别TCR克隆，UMI校正PCR重复，空间barcode定位TCR克隆。图2 Visium空间转录组产物中获取TCR序列的方法6例人脑转移瘤组织TCR空间转录测序数据显示（表1，图3），每个样本的UMI数范围为1-1973；单一克隆数为1-113不等，多样性shannon指数为0-3.89；TCR恢复与常规Visium空间转录组测序CD3E转录本数和流式细胞仪分选的CD8+浸润T细胞之间的相关性较为松散。图3 单细胞RNA测序验证TCR空间转录组测序结果(A)TCR扩增测序与常规Visium空间转录组检测CD3E(泛T细胞标志物)表达的相关性(B)单细胞RNA测序(scRNA-seq)验证四例空间转录组测序样本TCR序列结果。饼图为空间转录组测序中TCR克隆出现频次，并根据该克隆是否在CD4+/CD8+ T细胞scRNA-seq中发现而以颜色标记(C)克隆恢复后数据汇总。注:由于缺乏冷冻保存细胞，患者15的 CD4 +和PD-1 - CD8 + T细胞未测序另外，三例样本的CD8+T细胞和CD4+ T细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），1例样本的CD4+ T细胞进行了scRNA-seq。结果如图3C所示，scRNA-seq中识别到74.8%可识别UMI中的TCR。但患者27的TCR在两种测序中结果一致性不高，原因可能在于该样本的TCR存在多样性，且用于scRNA-seq的细胞量过少。
此外，作者还分享了一例肺癌脑转移样本（患者27）的Visium空间转录组测序结果（图4）。该样本经HE染色后分别进行了常规Visium空间转录组和TCR特异性空间转录组测序。图4B显示该样本有7个空间基因表达簇，以流式细胞仪分选CD4+ T细胞scRNA-seq作为平行对照，鉴定出7个CD4 + T细胞簇，分别为调节性T细胞(Tregs)、颗粒酶表达细胞和来自供体的健康原生细胞(图4C和4D)，在CD4 + T细胞簇间TCR的重叠最小(图4G和4H)。同样在TCR特异空间转录测序中均能测到上述CD4 + T细胞克隆，包括与Treg表型和颗粒酶表达相关的单个和多个克隆(图4E和4F)。此外，作者使用该技术表明衰竭性CD8 + T细胞表达的TCR克隆定位于肿瘤实质中。
(A)肺癌脑转移样本H&E染色(B)组织内基因表达簇。(C)三名患者CD4 + T细胞scRNA-seq，以UMAP为坐标绘制细胞(D)特定基因的表达(E和F) CD4 + 表达颗粒酶T细胞克隆的空间定位(E)和多Treg克隆的空间定位(F)。(G和H) scRNA-seq，CD4 + 表达颗粒酶T细胞克隆和多Treg克隆表型示意